Im 16. Jahrhundert galt Pilsen als Hauptpfeiler des Katholizismus in Böhmen. Ab 1578 war es Nichtkatholiken verboten, das Bürgerrecht zu erwerben. Deutsche erhielten ab 1500 nur noch Zugang zum Richteramt, wenn sie die tschechische Sprache beherrschten. Vier Jahre später mussten die Juden Pilsen verlassen und erhielten für 300 Jahre lediglich als geduldete Gäste tagsüber Zutritt in die Stadt. Ein zwölfköpfiger Rat mit Bürgermeister sowie ein sechs bis zwölf Gemeindeälteste umfassendes Gremium bestimmten die kommunalen Angelegenheiten in Pilsen, wo ein Stadtbrand 1507 fast die Hälfte der Bausubstanz vernichtete. 1532 hielt Kaiser Ferdinand I. (1503–1564) von Habsburg, seit 1526 König von Böhmen, Einzug in der Stadt. Im Ständeaufstand 1547 stand Pilsen loyal zum Kaiser und erhielt als Dank die erste Stimme in der Ständekurie im Landtag. Aus Furcht vor einer Pestepidemie in Prag floh Kaiser Rudolf II. (1552–1612) 1599 nach Pilsen, wo er neun Monate residierte und Gesandtschaften aus aller Welt empfing. Im böhmischen Ständeaufstand 1618–1620 bekannte sich Pilsen zu den Habsburgern, auch wenn 1618 ein Ständeheer unter Graf Ernst von Mansfeld (1580–1626) die Stadt nach Belagerung für drei Jahre besetzte und die Bürger mit Kontributionen belegte. Ein Teil des städtischen Archivs ging in dieser Zeit verloren. 1621 nahm der kaiserliche Oberbefehlshaber Graf Tilly (1559–1632) Pilsen erneut für die Habsburger in Besitz. Wiederholte Einquartierungen in der Stadt, deren Befestigung verstärkt wurde, führten zu hoher Verschuldung. 1627 erließ Kaiser Ferdinand II. zwar einen Teil der Verbindlichkeiten und nannte Pilsen als eine der sechs Königsstädte, die direkt dem Kaiser unterstanden, doch konnte Pilsen nicht von Konfiszierungen infolge der Rekatholisierung im Lande profitieren. Auch nach dem Ende des Dreißigjährigen Krieges blieb Pilsen eine katholische Bastion.

Die verheerenden Folgen des Großen Krieges hemmten, verstärkt durch zwei Pestepidemien (1680, 1714) und eine Feuersbrunst 1729, die wirtschaftliche Konsolidierung, die erst nach 1760 wieder an Fahrt aufnahm, zumal die Stadt in den Schlesischen Kriegen wechselnde Besatzungen aufnehmen und Kontributionen entrichten musste. Andererseits profitierte die Tuchmacherei von den Aufträgen der jeweiligen Regimenter. Durch eine Neuvermessung des Grundbesitzes 1779–1783 verlor Pilsen einen Teil seines Grundbesitzes vor den Mauern und damit wichtige Einnahmen. Die Gemeindeverwaltung wurde im aufgeklärten Absolutismus reformiert, eine vom Kaiser eingesetzte Renovationskommission stellte 1734 dem aus den städtischen Eliten gebildeten Rat und den Gemeindeältesten ein aus sechs Personen bestehendes Wirtschaftsdirektorium zur Seite. Im Zuge der Josephinischen Reformen wurden u. a. die innerstädtischen Friedhöfe aufgelöst, 1782 zudem das Dominikanerkloster. Einen Einschnitt bedeutete das Ende der mittelalterlichen Gemeindeordnung 1788. Ein von den Regierungsbehörden ernannter und juristisch ausgebildeter Bürgermeister sowie sechs Räte und weitere von der Stadt besoldete Beamte leiteten fortan die Geschicke der Stadt. Der Rückgang der Einwohnerzahl konnte erst in der ersten Hälfte des 19. Jahrhunderts ausgeglichen werden, als unter dem Bürgermeister Martin Kopecký (1828–1850) die mittelalterlichen Stadtmauern endgültig abgetragen wurden, ein Prozess, dessen Anfänge in das Jahr 1795 zurückreichen. In den Napoleonischen Kriegen besetzten russische und französische Truppen nacheinander die Stadt, ab 1825 gewann Pilsen als Militärstandort Bedeutung.

In der Revolution 1848 gründeten liberale Bürger um den Buchdrucker und Politiker Ignác Schiebl (1823–1901) nach Prager Vorbild den Verein „Lípa slovanská“ (Slawische Linde), der sich für die Gleichstellung beider Nationalitäten in Böhmen, d. h. Tschechen und Deutschen, engagierte. 1874–1878 wurde in dem noch kaum bebauten Vorort Bory eine Männerhaftanstalt errichtet, die als eine der „modernsten“ in der k. k. Monarchie galt und knapp 1.000 Schwerverbrechern und politischen Häftlingen Platz bot. Zu den politischen Gefangenen zählten in den 1890er Jahren Mitglieder der Gruppe „Omladina“ (Jugend) um den Politiker Alois Rašín (1867–1923) und den Dichter Stanislav Kostka Neumann (1875–1947). Ab 1894 bezeugte das erste „Arbeitervereinshaus“ (Dělnická beseda) in Böhmen das quantitative Wachstum und zunehmende politische Engagement der Arbeiterschaft (allein in den Škoda-Werken 1899: 3.000), die ab dem Anfang des 20. Jahrhunderts in Streiks politische Forderungen artikulierte.

Mit der sich abzeichnenden Niederlage der k. k. Monarchie gingen Proteste gegen die katastrophale Versorgungslage einher, wobei am 14. Oktober 1918 etwa 25.000 Arbeiter in Pilsen streikten. Mit der Gründung der Ersten Tschechoslowakischen Republik konstituierte sich hier ein tschechischer Nationalrat. Unter dem sozialdemokratischen Bürgermeister Luděk Pik (Amtszeit 1919–1938) entwickelte sich Pilsen auch dank Eingemeindungen 1924 mit gut 108.000 Einwohnern zu einer modernen Großstadt mit signifikanten Bauten wie etwa der Masaryk-Schule oder dem „Wolkenkratzer“ U Trojdohody (Zum Dreibund) des Architekten Hanuš Zápal (1885–1964).

Als Folge der Weltwirtschaftskrise 1929 zählte die Stadt über 15.000 Arbeitslose. Durch das Münchner Abkommen 1938 und die damit verbundenen Gebietsabtretungen wurde Pilsen zur Grenzstadt, mit der Errichtung des „Protektorats Böhmen und Mähren“ marschierte die Wehrmacht am 15. März 1939 auch in Pilsen ein, das Sitz eines Oberlandrats und mehrerer Behörden (SA, SS, Gestapo) wurde. Umgehend erfolgte die Einbindung der Škoda-Werke in die deutsche Rüstungsproduktion. Gegen Widerstand gingen die Besatzer rücksichtslos vor (u. a. 1943 Transport von mehr als 500 politischen Häftlingen in das KZ Buchenwald). Der Germanisierungspolitik dienten die 1942 verordnete neue Magistratsverfassung sowie der Wohnungsbau für deutsche Neuansiedler. Die mehr als 3.000 Pilsener Juden wurden ausgegrenzt, enteignet, diskriminiert und Anfang 1942 in drei großen Transporten zunächst in das Ghetto Theresienstadt/Terezin deportiert und von hier aus zur Ermordung in die Vernichtungslager im Osten. 1942–1945 wurden bei elf Luftangriffen fast 6.800 Gebäude und etwa 70 Prozent der Fabrikgebäude zerstört.

Am 5. Mai 1945 begann ähnlich wie in Prag der Aufstand gegen die deutschen Besatzer. Ein revolutionärer Nationalausschuss (Revoluční Národní výbor) übernahm provisorisch die Macht. Am 6. Mai marschierten Einheiten der US-Armee unter General George S. Patton (1885–1945) in der Stadt ein. Der Verhaftung von Repräsentanten der deutschen Okkupationsmacht folgte rasch die wilde Vertreibung Pilsener Deutscher, der sich ab Anfang August die systematische Aussiedlung anschloss. In den Folgejahren galt es, den Bevölkerungsverlust durch Zuzug aus dem Binnenland zu kompensieren und den Wiederaufbau zu forcieren. Dem diente auch die Übersiedlung der Medizinischen Fakultät der Karlsuniversität nach Pilsen. 1948 folgte die Pädagogische Fakultät, 1949 eine Hochschule für Maschinenbau und Elektrotechnik. Der kommunistischen Machtübernahme im Februar 1948 schloss sich die Verfolgung und Inhaftierung politisch Missliebiger im Gefängnis in Bory an, wo 1949 General Heliodor Píka (1897–1949), einer der Führer des Auslandswiderstands während des Zweiten Weltkrieges, nach einem stalinistischen Schauprozess exekutiert wurde. Die Škoda-Werke wurden symbolträchtig in Lenin-Werke umbenannt.

In den Gründungsjahren von Neu-Pilsen durch Verlegung der Vorgängerstadt kurz vor 1300 dominierten ethnisch wohl deutsche Siedler, doch bereits bis 1400 führte der Tschechisierungsprozess zu einem Gleichstand. Im städtischen Rat dominierten bis 1350 Deutsche, ab 1407 finden sich im zwölfköpfigen Rat in der Regel acht bis zehn tschechische und entsprechend zwei bis vier deutsche Namen. 1419 dürften 80 Prozent der Einwohner Tschechen gewesen sein. Im Spätmittelalter gehörte Pilsen nach Prag und Kuttenberg/Kutná Hora zu den größten Königsstädten Böhmens und zählte Anfang des 14. Jahrhunderts annähernd 3.000 Einwohner, zu denen 1.000 Personen extra muros hinzukamen. Hussitenkriege, Dreißigjähriger Krieg und die Pestausbrüche 1680 sowie 1714 führten zu einem Auf und Ab der demographischen Entwicklung, sodass Pilsen Anfang des 18. Jahrhunderts noch immer 3.000 Einwohner zählte. Erst durch die Industrialisierung kam es v. a. durch Zuwanderung von Arbeitskräften zum Bevölkerungswachstum (1843: 8.892, 1910: 80.000 Einwohner), das sich im 20. Jahrhundert fortsetzte, nach 1949 auch durch Eingemeindungen (1930: 115.000, 1972: 150.000, 1991: 173.008, 2019: 172.441 Einwohner).

Eine jüdische Ansiedlung in Pilsen ist bereits 1338 bezeugt, im 15. Jahrhundert entstand ein Ghetto mit zwei Synagogen, einer Schule und einem Friedhof. 1504 ließen sich die ausgewiesenen Juden in Blowitz/Blovice und Kassejowitz/Kasejovice nieder. Erst 1790 durfte sich wieder eine jüdische Kaufmannsfamilie in Pilsen niederlassen. 1850 eröffnete ein neues Bethaus, Pilsen wurde Sitz des Kreis-Rabbinats. Der Aufschwung der Lebensmittelindustrie zog im 19. Jahrhundert jüdische Unternehmen an. 1870 lebten 1.207 Juden in der Stadt, deren Zahl bis 1916 auf 3.517 stieg. Zwischen 1888 und 1893 entstand die Große Synagoge, nach jener in Budapest die zweitgrößte in Europa. 1938 lebten 3.200 jüdische Bürger in Pilsen, die in drei Transporten im Januar 1942 im Rahmen der sog. „Endlösung“ in das Ghetto Teresienstadt/Terezin und von dort in Vernichtungslager im Osten deportiert wurden. Nur 116 kehrten 1945 zurück. 2018 zählte die jüdische Gemeinde etwa 100 Mitglieder.

1860 entstand in Pilsen eine Niederlassung der Eisenwerke Sedlec (bei Starý Plzenec) des Grafen Ernst von Waldstein-Wartenburg (1821–1904), die neun Jahre später der u. a. in Prag und Karlsruhe ausgebildete Ingenieur (später in den Ritterstand erhoben und Mitglied des Wiener Herrenhauses sowie des böhmischen Landestages) Emil Škoda (1839–1900 ) erwarb – die Geburtsstunde der späteren Škoda-Werke, die ab 1866 zum größten Waffenproduzenten der k. k. Monarchie aufstiegen (u. a. Panzerkuppeln und Schiffskanonen), ab 1876 eine Niederlassung in Kiew für das Russische Reich unterhielten und ab 1899 als Aktiengesellschaft firmierten. Bei Ausbruch des Ersten Weltkrieges zählte Pilsen etwa 100 Fabriken. 1899 nahm das städtische Elektrizitätswerk seine Arbeit auf, zudem fuhr eine elektrische Straßenbahn. 1910 wurde im Stadtteil Bory ein Flughafen – der erste seiner Art in Böhmen – eröffnet.

Nach Gründung der Tschechoslowakei investierte ein französisches Industriekonsortium in die Škoda-Werke, mit 13.000 Beschäftigten größter Arbeitgeber, der ab 1928 auch die erste E-Lokomotive produzierte. Darüber hinaus wurden Industrieanlagen gefertigt und 1923 die heute weltweit bekannte Schutzmarke – der geflügelte Pfeil in einem Kreis – im Handelsregister eingetragen. 1925 übernahmen die Škoda-Werke den Fahrzeughersteller Laurin & Klement in Jungbunzlau/Mladá Boleslav.

1946 wurden die Škoda-Werke verstaatlicht und verschiedene Teile verselbständigt. Das v. a. auf den Export in die Länder des Rats für Gegenseitige Wirtschaftshilfe (RGW) ausgerichtete Werk in Pilsen konzentrierte sich auf die Herstellung von Anlagen für den Schwermaschinenbau, den öffentlichen Nahverkehr und die Energetik. 1991 übernahm VW 70 Prozent an den Automobilwerken Škoda, den Rest im Jahre 2000. Die Škoda-Werke in Pilsen selbst wurden 1991 privatisiert.

Von den Sakralbauten auf der Alt-Pilsener Burg und im Suburbium sind lediglich die Grundmauern der Hl.-Kreuz-Kirche sowie die vorromanische ottonische Rotunde St. Peter (ausgehendes 10. Jahrhundert), die zu den ältesten Bauten in Böhmen gehört, noch vorhanden. Während der Gründung von Neu-Pilsen übernahm die 1295 als gotischer Bau auf dem Ring begonnene Kirche St. Bartholomäus nach 1322 die Funktion einer Pfarrkirche, die Ende des 15. Jahrhunderts vollendet und zuletzt 1879–1883 von Josef Mocker (1835–1899) sowie 1914–1923 von Kamil Hilbert (1869–1933) im Stil der Neogotik umgebaut wurde. Die dreischiffige Erzdiakonatskirche (heute bischöfliche Kathedrale) mit ihrem 102 Meter hohen, nach einem Brand 1835 erneuerten Turm beherrscht zusammen mit dem dreigeschossigen, 1907–1912 von Jan Koula (1855–1919) neu gestalteten Renaissancerathaus von 1558 den Ring, auf dem auch die 1681 von Christian Widmann geschaffene, 1714 um weitere Heiligenfiguren ergänzte Pestsäule steht. Ebenfalls am Markt und seinen angrenzenden Gassen finden sich zahlreiche restaurierte Renaissance-, Barock- und Empirehäuser, darunter das 1607–1609 für Kaiser Rudolf II. (1552–1612) von Giovanni Maria Filippi (1565–1630) umgebaute Kaiserhaus. Gegenüber dem spätgotischen Wasserturm liegen die 1392 erbauten Fleischbänke. Am südöstlichen Ende der Altstadt befinden sich das Franziskanerkloster (1295) mit der im 13.–16. Jahrhundert erbauten, vom Pilsener Baumeister Jakob d. J. Auguston (1735) barock umgestalteten dreischiffigen Kirche Mariä Himmelfahrt sowie die 1370–1380 errichtete Barbarakapelle. Auch das Erzdiakonatsgebäude am Markt, die zweitürmige Barockkirche St. Anna sowie das benachbarte Dominikanerinnenkloster (1710–1714), das nach seiner Auflösung 1782 zunächst als von den Prämonstratensern betriebenes Gymnasium fungierte und nach Umbauten 1805–1809 heute als wissenschaftliche Bibliothek dient, verdienen Beachtung. An der Stelle des 1895 abgerissenen Dominikanerklosters stehen der 1899–1902 errichtete Justizpalst sowie ein Gefängnis (heute Archiv).

Östlich des Stadtkerns befindet sich seit 1842 das Areal des Bürgerlichen Brauhauses „Prazdroj“ (Urquell), östlich davon wiederum die 1869 gegründete Gambrinus-Brauerei. 1908 wurde der Hauptbahnhof mit seiner 36 Meter hohen Kuppel im Neorenaissancestil durch die Pilsener Baufirma Rudolf Štech fertiggestellt. Unweit hiervon stehen die 1745 nach Plänen von Matthias Andreas Kondela erbaute Kirche zum Jesulein sowie die einschiffige gotische Friedhofskirche St. Nikolaus (1406–1410; 1739–1744 barockisiert), neben der u. a. der Begründer des tschechischen Dramas Josef Kajetán Tyl (1808–1856), der in seinem 1834 in Prag uraufgeführten Werk „Fidlovačka“ (Das Schusterfest) den Text der heutigen tschechischen Nationalhymne schrieb, und Emil Ritter von Škoda (1839–1900) ruhen.

1818 fand in Pilsen die erste Theateraufführung in tschechischer Sprache statt, wobei das Stück „Die Befreiung Pilsens von den Taboriten“ (Osvobození Plzně od Taboritů) gespielt wurde, dessen deutsche Originalversion von dem Schriftsteller Anton Fischer stammte. 1832 wurde das erste feste, in klassizistischem Stil durch den Baumeister Lorenzo Sacchetti (1759–1836) errichtete Theater eröffnet. 1902 folgte das nach Plänen von Antonín Balšánek (1865–1921) erbaute Große Theater, dessen Bau seit 1899 Spenden der Bürgerschaft ermöglichten und das mehr als 1.000 Zuschauern Platz bot. 1912–1916 wirkte hier der Dirigent Václav Talich (1883–1961), dessen Opernaufführungen berühmt waren. Der Pilsener Puppenspieler Josef Skupa (1892–1957) erfand die legendären Figuren Spejbl (1919) und Hurvínek (1926).

Als ältester böhmischer Wiegendruck gelten die 1476 in Pilsen anonym gedruckten, 1349 entstandenen Statuta provincilia des ersten Prager Erzbischofs Ernst von Pardubitz (um 1300–1364). Die tschechische Übersetzung der im Spätmittelalter äußerst populären Historia destrucionis Troiae des Guido de Columna (1210–1287) wurde unter dem Titel Trojanská kronika hingegen nicht wie lange Zeit vermutet 1468, sondern erst 1484–1486 in Pilsen gedruckt und ist lediglich in drei Exemplaren (zwei in Prag, eins in Wien) erhalten. Darüber hinaus ist in der Stadt zwischen 1498 und 1511 die Offizin des aus Oberungarn (Slowakei) stammenden Mikuláš Štětina nachweisbar, der Werke in tschechischer Sprache druckte. Neben religiöser Literatur erschienen hier 1508 die Reisebeschreibungen von Amerigo Vespucci (1454–1512) – Spis o nowych zemiech. A o nowem swietie. O niemžto gsme prwe žadne znamosti neměli (Schrift über neue Länder. Und über die neue Welt. Von der wir anfangs keine Kenntnisse hatten). Eine weitere Offizin betrieb zwischen 1526 und 1530 der aus Schwabach stammende und in Nürnberg ausgebildete Johann (Jan) Pekk, der vor allem theologische Bücher druckte und mit dessen Tod der Buchdruck in Pilsen für fast zweieinhalb Jahrhunderte zum Erliegen kam.

Zu den bekanntesten böhmischen Humanisten zählt der aus Pilsen stammende Katholik Kašpar Kropač von Kozince (Cropacius) (1539–1580), der 1560 in Wien den Ehrentitel „Poeta laureatus“ erhielt und nachfolgend in Prag und Pilsen lebte. Weite Verbreitung fanden seine lateinischen Hymnen und Epigramme.

In der Zeit von Aufklärung und Josephinischen Reformen erlebte der Buchdruck 1787 einen Neubeginn durch den aus Tirol stammenden und in Prag zum Buchdrucker geschulten Joseph Johann Morgensäuler (1748–1816), der einen Verlag mit späteren Niederlassungen in Klattau/Klatovy und Leipzig gründete. 1790 eröffnete Morgensäuler zudem die erste Leihbibliothek in Pilsen. 1864–1869 erschien als erste tschechische Zeitung die „Plzeňské noviny“ (Pilsner Zeitung), in der Folge bildete sich eine tschechische Presselandschaft heraus (u. a. Český lev/Böhmischer Löwe, 1870–1872, Plzeňské listy/Pilsner Blätter, 1891–1911) sowie die sozialdemokratische Zeitung „Posel lidu“ (Volksbote, 1892–1894). An deutschen Zeitungen gab es die „Pilsner Bösen Zungen“ (1876), vor allem aber das „Pilsner Tagblatt“ (1900–1918). Die Zweisprachigkeit war, trotz wachsender ethnisch-nationaler Separierung, bei den Bewohnern Pilsens im 19. Jahrhundert stark ausgeprägt. Die deutschsprachige Zeitung „Pilsner Bote“ (1854–1869) und deren Nachfolgeblätter „Pilsner Reform“ (1870–1899) sowie „Echo aus Pilsen und Westböhmen“ (1899–1902) erschienen in der Druckerei des tschechischen Politikers Ignác Schiebl (1823–1901), der ab 1883 auch Präsident der Handels- und Gewerbekammer Pilsen war.

In Pilsen unterrichtete 1873–1908 der anfänglich auf Deutsch, später auf Tschechisch publizierende Schriftsteller und Chronist des Böhmerwaldes Karl/Karel Klostermann (1848–1923), dessen Grab sich auf dem Zentralfriedhof befindet, an der deutschen Staats-Realschule Deutsch und Französisch.